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如何做出稳定可重复、背景干净的 western 条带?
点击次数:406 发布时间:2018/1/12

 

一:蛋白质的样品制备

由于这一步方法各异,具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。蛋白质的样品制备是 Western Blotting 的第一步,样品制备是关键步骤,要求尽可能的获得所有蛋白质,应注意以下问题:

在合适的盐浓度下,应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

选择合适的表面活性剂和还原剂,破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键,使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子。

防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰,制备过程应在低温下进行,以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰(加入合适的蛋白酶抑制剂)。

样品建议分装成合适的量(比如分装出 20 ul 检测蛋白质定量用),然后于 -20 ℃ 或 -80 ℃ 中长期保存,但要注意不要反复冻融,因为会使蛋白的抗原特性发生改变。

若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验,也就很难做出好的结果了。除此之外 loading buffer 的作用也不容忽视,切莫使用不新鲜的上样缓冲液,同时在处理时也应注意将样品与 loading buffer 混合均匀。

二:蛋白质定量

如果要定量的话,一般选择 BCA 或者 Bradford 方法,BCA 要求检测波长为 562 nm,Bradford 为 595 nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果,建议先把 lysis buffer 加入 BCA 工作液或考马 G250 混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后,计算含 50~100 ug 蛋白的溶液体积即为上样量(一般 8 cm 宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为 150 ug,所以如果从组织提取蛋白的话上样量不宜过大)。

网上有人喜欢等质量上样(即每个泳道的上样体积不一但质量一定),也有使用等体积上样(即先把各个样品稀释到某一固定浓度,然后等体积等质量上样,计算上样体积时需包含 loading buffer 的体积)。按分子克隆的说法,还是使用等体积上样比较好。

上样总体积一般不超过 15 ul,加样孔的最大限度可加 20 ul 样品。上样前要将样品置于烧杯内,将烧杯置于石棉网上用酒精灯加热至沸腾,在沸水中煮 3~5 min 使蛋白充分变性。也可以使用 PCR 仪 95° 加热 5 min,效果佳,操作方便。之后样品可以在 4 ℃ 冰箱短时间保存,也可在 -20℃ 冰箱保存数月,但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。

三:SDS-PAGE 电泳

1. 清洗玻璃板

蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。若不继续使用,需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来,玻璃板之间垫玻璃纸隔开。梳子应用水洗干净,临用前用无水乙醇擦拭晾干。

2. 灌胶与上样

① 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作前先往玻璃板间灌水,检查是否漏)。

② 按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置,最后加入 TEMED,之后摇匀即可灌胶。配制凝胶时要充分混匀,此外应保证试剂的新鲜,特别是过硫酸铵。

灌胶时掌握好速度,避免气泡产生(注意浓度越小的胶含水越多,凝固后胶体积缩小越多)。然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢,否则胶会被冲变形)。

未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡。注意给积层胶留出足够的空间(分子克隆推荐长度为插入的梳齿长再加 1 cm)。

③ 当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。聚合时间由 AP 以及 TEMED 决定,通常在 30 min 左右,AP 不新鲜会导致聚合变慢,气温较低时胶是会凝得慢一些,必要时可适当增加 AP 以及 TEMED 的量,但通常不会超过 1 h,若超过 1 h 甚至更长仍未聚合,应检查配制的操作有无错误。

由于 TEMED 催化 APS 释放相关化学基团,再由 APS 释放的基团催化 Acr/Bis 聚合,所以如果 APS 不新鲜的话加再多的 TEMED 效果也不佳,这就是为什么推荐 APS 每周新鲜配置的原因。

④ 按说明书配积层胶,加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固前最好在两边补胶至刚刚冒顶。待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

⑤ 趁积层胶聚合的这段时间,取适当体积样本混合 1X SDS loading buffer(最好事前分装好,每次从冰箱里取一管即可),95~100° 加热 5 min,若有沉淀可用稍低温度,比如 45~55° 加热 1 h 达到变性的目的。我一般习惯分装 20 ul 到 PCR 管里,先和 loading buffer 混合好,临用前用 PCR 仪加热 95 °C 5 min,效果不错。

⑥ 胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上,加入电泳缓冲液后开始准备上样(我们使用的是大连竞迈科技公司的 MV-III 型小型单垂直板电泳槽,电泳液至少要漫过内测的小玻璃板,电泳槽下面不用倒太多电泳液)。加样前可用 5 ml 注射器或加样器先冲洗一下加样孔。用微量加样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次,以免交叉污染。

目前我们做的 mini 胶上有 10 个上样孔,一般在第一个孔加入 marker(我用的是 Fermentas 预染 marker),其余 9 个孔加入样品,也可在头尾孔内加入 marker,中间 8 个孔加样品。加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品。在未加样的孔中应加入等量的样品缓冲液。上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。也可使用 10 ul 的枪头就行,比用微量加样器快很多,用枪头时注意不要插得太深,容易把玻璃板撑开,样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了。

3. 电泳

电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,网上有资料建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通,但是在《分子克隆》上却反对这种做法,理由是会破坏缓冲系统 pH 的不连续性。

请各位按照实际经验来做即可。电泳时间和电压说法各异。按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。

电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印

四:转膜

我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。对于转印 90 kd 以下的蛋白,转膜液都不用加 SDS,如果是蛋白分子量大的话可以加入 0.037 % 的 SDS。

1. 在电泳结束前 20 min 开始准备转膜所需的东西。转一张膜需准备 6 张的滤纸(长一般为 8.1~8.3 cm,宽度根据裁的胶大小实际测量,但胶一般会缩水,所以裁 8 cm 就行)和 1 张 PVDF 膜。切滤纸和膜时一定要戴干净手套,因为手上的蛋白会污染膜。PVDF 膜使用前用无水甲醇中浸泡 1 min~2 min。目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团,使它更容易跟带负电的蛋白质结合,做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

2. 将玻璃板撬开才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板(撬时一定要小心,玻板很脆弱,我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲,效果出奇的好)。除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去,要避免把分离胶刮破。也可取 10 ml 注射器吸满转印缓冲液,往玻璃板与凝胶之间注水,使液体的压力将两者自然分开。

取出凝胶后应注意分清上下,可以在右上角裁一个小角。之后有两种方法供选择,一是按照 marker 指示,把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来,二是把整张胶转膜,前一种方法更加节约材料,但操作稍微麻烦了一点。在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的 PVDF 膜和滤纸,平衡 10 min 左右,也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的 SDS。

3. 带上手套,平放转移槽的底座,依次在石墨电极上叠放 3 张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF 膜(此时可在 PVDF 右上角减去一个角,以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面)、刚刚完成电泳的凝胶和另外 3 张浸泡过缓冲液的滤纸。用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动,除去气泡。注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡,因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。

用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干(这一步很重要,宁可太干也不能太湿,太干容易烧胡,太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路,大大降低转移效率,如果同时转好几条胶的时候更要小心,有一个胶短路就会影响整体的转移效率)。最后将转移槽的上盖扣上,接通电源开始转膜。

由于设备昂贵,第一次操作应向熟手请教,否则短路可能烧坏设备!转完后立即清洗设备,特别是金属上盖,转膜液特别容易在金属上盖上形成结痂,影响设备的正常使用,我们实验室今年做 western 的同志因为忽略这一点,转膜仪烧坏了好几次。

4. 依据分子量大小电泳 15~60 min。如果初次转膜,可以根据一般经验,即多少 kD 的蛋白就转多少分钟,再根据结果调整时间。之后断开电源,取出转移膜进行后继实验。

5. 为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,最好使用预染。传统方法是将膜用 1×丽春红染液染 5 min(于脱色摇床上摇)。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。实际上更常用且简便的方法是先将膜晾干,然后浸入 20% 的甲醇,待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带(此方法仅仅适合 PVDF 膜)。将膜晾干备用。使用预染 marker 话可以看见 marker 的颜色转印到了膜上,但是凭借这个颜色来判断是否转印完全或转印过头是不可靠的。

五:免疫杂交反应

1. 将膜移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h 即可。如果是自己配置的封闭液,最好过滤一下以消除固体杂质。实际经验表明与其封闭过夜,不如一抗孵育过夜。

2. 将一抗用封闭液稀释(一般用封闭液稀释即可,如果背景不高用 TBST 稀释也可以,当然熟练后还可以自由发挥,配制一些自己的复方稀释液)至适当浓度(可以在 1.5 ml EP 管中配置工作液,常用稀释倍数为 1:200,1:500,1:1 000,具体需要预实验进行摸索,用后可回收重复用 2~3 次,但回收重复利用的效果如何就要看抗体的质量,分装的抗体不推荐回收。稀释后应在 2~3 天内使用,4 度保存,避免反复冻融。)

撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上,四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;将抗体溶液加到保鲜膜上;从封闭液中取出膜,用滤纸吸去残留液后,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜四角以赶出残留气泡(也可使用手术室的病理袋,质量不错,减去下面的折叠部分,用封口器(40~80 元一个)封上,不漏液即可)。37° 孵育 1 h 之后转移到室温下再孵育 1 h(或者 4°孵育过夜),用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次,每次 10 min;再用 TBS 洗一次,10 min。也可以多洗几次,比如 4 次,每次 5 min。

3. 在培养皿内加入二抗稀释液(10 ml 足够了,一般 1:1 000 甚至 1:10 000 用 TBST 稀释),放在摇床上,室温下孵育 1~2 h 后,用 TBST 在室温下脱色摇床上洗两次,每次 10 min;再用 TBS 洗一次,10 min,进行化学发光反应。选择好一个合适的条件不要轻易改变,另外相比一抗,二抗作用的时间应严格控制,实践证明一抗时间长点可能没什么关系,而二抗时间若过长过短都将会直接影响结果。二抗孵育之后还要注意好好洗涤,否则显影是背景可能脏。

六:化学发光(ECL),显影,定影

1. 现在工作台上铺一张保鲜膜,将 PVDF 膜放在保鲜膜上。将 ECL 的 A 和 B 两种试剂在 EP 管内等体积混合(注意吸完 A 试剂后吸 B 试剂前要患枪头),然后均匀滴在 PVDF 膜的蛋白面,反应 1~2 min 后,将 PVDF 膜上多余的 ECL 工作液吸干,之后转移到在 X 片夹中预先铺好的保鲜膜上一侧,把另一侧翻过来盖在其上。用透明胶把保鲜膜固定在片夹上。

2. 在暗室中,将 1×显影液和定影液分别到入塑料盘中;在红灯下取出 X-光片,用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大 1 cm);打开 X-光片夹,把 X-光片放在膜上,一旦放上,便不能移动,关上 X-光片夹,开始计时;根据信号的强弱适当调整曝光时间,一般为 1 min 到 2 min,也可选择不同时间多次压片,以达最佳效果(也有人重叠压好几张片,固定曝光 5~10 分钟,从这好几张片中选出最合适的底片);曝光完成后,打开 X-光片夹,取出 X-光片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。

显影时间一般为 1~2 min(20~25 ℃),温度过低时(低于 16 ℃)需适当延长显影时间;显影结束后,马上把 X-光片浸入定影液中,定影时间一般为 5~10 min,以胶片透明为止;用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干(注意:显影和定影需移动胶片时,尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对结果产生影响)。

X 光片一般选用柯达原装的生物实验专用柯达 X-OMATBT 胶片 .显影液和定影液最好每周配置一次,避光室温保存,显影和定影液是最便宜的试剂了,千万不要因为它而影响了整个结果。

七、凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值,比如 bio-rad 的 Quantity One。如何使用敬请关注我们下一期内容。

 

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